Berbicara tentang pengungkapan fungsi gen, khususnya pada tanaman, tekniknya telah banyak diketahui saat ini. Mulai dari teknik over-ekspresi, antisense, penyisipan atau insersi T-DNA (transfer-DNA) sampai RNAi (RNA interference). Dari semua teknik tersebut, insersi T-DNA merupakan teknik yang paling banyak menyumbang pengungkapan fungsi gen. Sebagai tindak lanjut dari program sekuen genomik pada Arabidopsis, koleksi mutan T-DNA (www.arabidopsis.org) telah menunjukkan kegunaannya (fungsinya: red) dalam mempelajari fungsi suatu gen. Meskipun koleksi T-DNA telah berhasil mengungkapkan berbagai fungsi gen pada tanaman dikotil Arabidopsis melalui pendekatan mematikan atau “meng-KO” (knock out) gen tertentu, namun Arabidopsis tersebut hanya merupakan tanaman model dan hanya tepat ntuk analisa dalam laboratorium.
Tren yang sedang berkembang saat ini adalah melakukan teknik yang sama (insersi T-DNA) pada tanaman aplikasi seperti tanaman pangan (serealia). Salah satu tanaman pangan penting adalah padi. Keunggulan padi dibanding tanaman serealia lainnya dalam hal aplikasi pekerjaan rekayasa genetik diantaranya adalah bahwa padi memiliki jumlah kromosom relatif kecil yaitu 12 dan genom padi telah komplit diungkapkan. Selain itu padi merupakan bahan makanan pokok yang dikonsumsi oleh hampir seluruh penduduk dunia. Maka pengungkapan fungsi gen pada padi merupakan sebuah terobosan yang tidak ternilai untuk kehidupan manusia.
Padi menjadi model untuk tanaman sereal lainnya karena ukuran genomnya yang relatif kecil yaitu 430 Mb (1), siklus hidup yang relatif singkat, kemudahan transformasi, serta komplitnya proyek genom padi itu sendiri (2,3). Selain itu, sejumlah gen telah dipelajari melalui metode genetik klasik. Maka penyediaan galur mutan dalam skala besar sangat bernilai dalam mengungkap fungsional genomik pada padi. Galur mutan dengan T-DNA tagging (telah tersisipi T-DNA) menjadi pilihan dalam mengungkap fungsi suatu gen.
Insersi T-DNA pada padi
T-DNA sebenarnya merupakan bagian dari tumor inducing (Ti) plasmid yang ada di Agrobacterium tumefaciens dan dibatasi oleh dua bagian tepi (left border dan right border). Dan telah terbukti bahwa T-DNA bisa berfungsi sebagai suatu mutagen (penyebab mutasi) (4). Istilah T-DNA tagging lines (galur T-DNA tagging) telah biasa digunakan secara umum untuk menyebut galur mutan transgenik hasil transformasi. Modifikasi dari T-DNA dengan berbagai macam strategi telah menghasilkan berbagai pilihan dan kemudahan dalam mendeteksi gen yang terinsersi oleh T-DNA. Salah satu contoh modifikasi insersi T-DNA adalah sistem gene trap. Sistem ini dibuat karena insersi T-DNA yang bersifat random dalam arti efek gangguan ekspresi pada gen tertentu tergantung dimana tempat insersinya (5). Maka dari itu, suatu gen yang berfungsi untuk reporter (penanda) mutlak diperlukan untuk mengetahui lokasi insersi T-DNA pada genom sehingga efek “knock out” dalam mempelajari fungsi gen bisa ditemukan. Gen reporter yang paling sering digunakan adalah GUS (beta-glucuronidase). Gen ini memiliki keistimewaan antara lain deteksi yang akurat dari produk gennya dan ketahanan fusi translasi terhadap aktivitas enzimnya (6).
Transfromasi T-DNA, termasuk sekuen yang terapit diantara dua border, pada tanaman umumnya menggunakan Agrobacterium tumefaciens. Agrobacterium tumefaciens sebenarnya merupakan bakteri tanah yang bertanggung jawab terhadap terbentuknya induksi tumor dan memiliki kemampuannya mentransfer DNA pada sel tanaman. Tidak hanya itu saja, DNA yang telah tertransfer bisa berintegrasi dengan genom tanaman. Kemampuan inilah yang menjadikan Agrobacterium sebagai alat transfer DNA yang paling sering digunakan dalam bioteknologi. Tidak seperti Arabidopsis yang menggunakan teknik pencelupan bunga (flower dip) (7) untuk transformasi, pada padi teknik yang dipakai adalah melalui metoda ko-kultivasi (8) dengan menggunakan callus.
Deteksi integrasi T-DNA pada padi
Penggunaan reporter gen untuk mendeteksi insersi T-DNA pada padi transgenik telah dikembangkan oleh An Gynheung dengan membuat binary vector (vektor biner) yang mengandung reporter GUS tanpa promoter. Reporter GUS dalam vector biner tersebut terletak tepat bersebelahan dengan right border dalam T-DNA (8,9). Maka dari itu, insersi T-DNA pada suatu gen tidak hanya merusak target gen, namun promoter gen yang mengapitnya bisa menyebabkan reporter GUS “ON” jika orientasi dan posisinya tepat.
Karena GUS merupakan suatu enzim, maka penambahan substrat (5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide (X-Gluc)) dari luar akan menyebabkan enzim tersebut aktif dan mengkatalisis substrat dengan menghasilkan produk berupa warna biru. Cara ini dikenal dengan “GUS assay” dimana bagian dari organ tertentu seperti daun, bunga, endosperma atau batang dipotong dan direndam dalam larutan yang mengadung buffer dan substrat X-Gluc. Rendaman dibiarkan pada suhu 37oC selama kurang lebih 6 jam. Meskipun hasil reaksi berupawarna biru sudah nampak, namun perlu diperhatikan bahwa kadang kala warna tersebut sedikit dikaburkan oleh adanya klorofil (zat hijau) dalam organ tertentu terutama daun.
Untuk menghilangkan klorofil tersebut, maka diperlukan perendaman dalam etanol secara gradual mulai konsentrasi 75%, letakkan pada suhu 60oC selama 6 jam, selanjutnya diganti dengan etanol 95% dan letakkan lagi pada suhu 60・C sampai warna biru benar-benar jelas (10). Lokasi spesifik dari warna biru menunjukkan dimana gen yang terinsersi tersebut berperan (lihat gambar). Ekspresi spesifik pada organ tertentu seperti bunga, akar, daun atau endosperma sangat berguna dalam pendugaan awal fungsi gen.
Gambar 1. GUS assay pada galur T-DNA tagging: a. biji; b. daun; c. bagian organ bunga
Hal lain yang diperlukan dalam mendeteksi galur T-DNA tagging adalah penentuan genotip (genotyping) melalui PCR (polymerase chain reaction) atau biasa disebut genotyping-PCR. Genotyping-PCR menggunakan DNA genom sebagai cetakan (template). Hal ini diperlukan dalam menyeleksi atau skrining homozigot (kedua untai DNA genom terinsersi T-DNA). Karena hanya dengan menemukan homozigot, kita bisa meraba dalam menyimpulkan fungsi dari suatu gen. Satu lagi deteksi yang harus dilakukan yaitu RT-PCR (reverse-transcriptase PCR) untuk memperkuat dalam memastikan bahwa suatu gen benar-benar telah “KO”. Cetakan yang digunakan adalah RNA dari mutan dan tipe normal (wild type) sebagai pembanding. Hasil RT-PCR dengan menggunakan primer gen spesifik akan menghasilkan produk jika template RNA berasal dari wild type, sebaliknya tidak akan menghasilkan produk jika menggunakan template RNA dari mutan. RT-PCR dengan menggunakan cetakan RNA dari berbagai organ atau jaringan tertentu dari wild type bisa dijadikan sebagai pola ekspresi suatu gen. Dimana terdapat produk hasil RT-PCR dengan intensitas tertinggi, biasanya disitulah suatu gen melakukan fungsinya.
Penentuan fenotip
Tahap akhir dalam menentukan fungsi gen dari galur T-DNA tagging adalah penentuan fenotip. Fenotip merupakan penampakan khusus yang disebabkan oleh mutasi dan berbeda dengan wilt type. Bertolak dari ekspresi GUS pada organ tertentu yang didukung dengan data RT-PCR, maka fungsi gen bisa dengan cepat dideteksi. Sebagai contoh: gen A yang terinsersi T-DNA memiliki ekspresi GUS pada bagian bunga saja, dan hasil RT-PCR menunjukkan bahwa ekspresi (transkrip) gen tertinggi terdapat pada bagian bunga, di tambah dengan fenotip yang tampak seperti terjadinya perkembangan bunga yang tidak normal pada mutan tersebut. Dari sini dapat ditarik sebuah kesimpulan bahwa gen A bertanggung jawab terhadap proses perkembangan bunga. Meskipun masih banyak data pendukung yang harus dikumpulkan dalam mengungkapkan fungsi suatu gen, penyimpulan awal dengan beberapa data yang berasal dari galur T-DNA tagging tergolong akurat. Beberapa fenotip lainnya yang sering dijumpai pada galur T-DNA tagging adalah chlorina (penguningan daun), albino (berwarna putih), blast (lesi pada daun), dwarf (kerdil/ pendek), opaque (endosperma berwarna putih) dan lain sebagainya (lihat gambar).
Gambar 2. Fenotip galur T-DNA tagging: a. albino; b. blast; c. dwarf
Hasil yang bisa dicapai
Dengan menggunakan teknik insersi T-DNA untuk menghasilkan galur T-DNA tagging dalam skala besar merupakan suatu langkah awal untuk membongkar seluruh fungsi gen pada padi. Suatu terobosan yang luar biasa, karena melalui teknik ini suatu tanaman padi yang telah terinsersi T-DNA dapat dengan mudah dibedakan antara homozigot, heterozigot atau wild type-nya dengan hanya melakukan PCR-genotyping. Sedangkan pola ekspresi gen yang mengalami mutasi juga dapat dengan mudah dideteksi dengan GUS assay. Penampakan fenotip yang mendukung, akan menambah kejelasan dari fungsi suatu gen. Dengan demikian, penyediaan sebuah data base tentang galur T-DNA tagging pada padi akan sangat menjanjikan di masa yang akan datang dan tidak menutup kemungkinan akan terjadi dalam waktu yang cepat. Sehingga pada akhirnya manusia dapat dengan mudah melakukan rekayasa padi untuk meningkatkan kesejahteraannya.
Daftar bacaan:
1. Burr, B. Mapping and sequencing the rice genome. Plant Cell 2002; 14: 521-523
2.Hiei, Y., et al. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant J 1994; 6(2): 271-282.
3. Sasaki, T. The rice genome project in Japan. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998; 95: 2027-2028
4. Feldmann, K.A. T-DNA insertion mutagenesis in Arabidopsis: mutational spectrum. Plant J 1991; 1(1): 71-82
5. Azpiroz-Leehan, R. and Feldmann, K.A. T-DNA insertion in Arabidopsis: going back and forth. Tren. in Gen 1997; 13(4): 152-156
6. Jefferson, R.A., et al. GUS fusion: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J 1987; 6: 3901-3907
7. Clough, S.J. and Bent, A.F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J 1998; 16(6): 735-743.
8. Lee, S. et al. 1999. Binary vectors for efficient transformation of rice. J. Plant Bio 1999; 42(4): 310-316.
9. Jeon, J.S., et al. T-DNA insertional mutagenesis for functional genomics in rice. Plant J 2000; 22(6): 561-570
10. Jefferson, R.A. GUS protocols: using the GUS gene as a reporter of gene expression. In: Gallagher S.R. (ed); pp.103-113
